中医方证代谢组学研究中心隶属于国家中医药管理局，依托黑龙江中医药大学。中心整合了国家中医药管理局中药血清药物化学重点研究室、中药血清药物化学三级实验室、黑龙江省中药血清药物化学重点实验室、黑龙江省高校中药材质量控制重点实验室、黑龙江省中药材GAP研究中心、黑龙江省高校中药材标准化工程技术中心等实验技术平台，并依托于国家中药学和药学一级学科、国家中药鉴定学教学团队、黑龙江省中药血清药物化学研究科技创新团队等人力资源进行建设，中心与美国Waters公司合作建立了“中美中医方证代谢组学技术合作中心”，研究中心主任为王喜军教授。 一学术研究概况
中医方证代谢组学[Chinmedomics（ChineseMedicine Metabolomics）] 是2011年由王喜军教授正式提出的解决中药有效性等相关科学问题的理论或研究策略（OMICS.2012；16（7-8）：414-421）。其内涵是利用代谢组学技术发现并鉴定中医证候/病生物标记物；利用中药血清药物化学方法分析方剂对应证候有效状态下体内直接作用物质的显效形式；将血清中外源性中药成分与内源性药效标记物相关联，提取与证/病标记物高度关联的外源性中药成分作为潜在的中药药效物质基础，并进行生物学验证，发现并确定中药药效物质基础，解决有效性相关问题的应用科学。
1. 研究思路
中药有效性评价是挖掘和揭示中医药治疗优势前提，证候和方剂是与中药有效性直接相关的关键科学问题。
首先，中药药物的有效性是针对中医学的证候或病。诸如心脾两虚证，该证临床以心悸失眠，纳差腹胀，便溏出血为主要表现的证候。本证常见西医的神经官能症、贫血、心律失常、心肌炎等疾病，简单的用任何上述疾病的疗效评价标准绝不足以评价归脾汤治疗心脾两虚症的疗效。这不仅是证的问题，而对中医病而言亦是如此。如，消渴病是中医传统的病名，是指以多饮、多尿、多食及消瘦、疲乏、尿甜为主要特征的综合病证。从现代医学角度认识其主要特征为高血糖及尿糖，以治疗糖尿病的疗效标准也不足以评价治疗消渴病的中药疗效。其次，中药的临床使用形式是方剂，方剂才是药物，广义的中药有效性实际上是方剂的临床有效性。单味中药有其特有的药性，不同的药性配伍组成方剂（单方除外）才能表达中药的临床疗效。事实上，中药饮片仅含有化学成分并具有相关的生物活性，同一中药在不同的配伍环境（方剂）中，在体内表达不同的体内直接作用物质，从而实现了方剂配伍的药效取向。
由此，以证候生物学实质或标记物研究为切入点，以方剂为研究对象才能有效地阐释中药的有效性；而相关的中药药效物质基础也必须在方剂显效状态下的体内直接作用物质中发现并鉴定。按此研究设计可通过多种途径结合多种现代分析技术及生物学技术阐释和鉴定中医证/病的生物标记物，通过大量的研究积累，终可提炼出有效的方法，实现中药疗效评价体系的建立，其下游的方剂疗效评价及药效物质基础发现等相关问题便迎刃而解了。
基于此，王喜军教授的团队提出解决证候生物学实质、方剂临床疗效评价、药效物质基础发现等关键问题的新方法或新策略——中医方证代谢组学（Chinmedomics）。即利用代谢组学技术发现并鉴定中医证候/病生物标记物，以证/病的生物标记物为桥接复制与证/病关联的动物模型，建立中药药效的生物评价体系；在显效状态下，利用中药血清药物化学方法分析体内来源于方剂的直接作用物质；结合证/病的生物标记物及中药体内直接作用物质的变化规律，建立血清中外源性中药成分与内源性标记物两组变量关联度分析方法，提取与证/病标记物高度关联的外源性中药成分作为潜在的中药药效物质基础，并进行生物学验证，从而发现并确定中药药效物质基础。 黑龙江中医药大学王喜军教授科技创新团队（2016年摄于哈尔滨）
通过黄疸证等9个中医证候标记物及茵陈蒿汤等14个方剂有效性及其药效物质基础的研究实践，使中医方证代谢组学理论和方法在4个方面得到融合与完善；①证/病的生物标记物的鉴定技术；②基于证/病的生物标记物桥接的证候相关动物模型制备技术，以及基于此的方剂药效的生物评价体系（Bio-Evaluation System，BES）；③方剂体内直接作用物质的显效形式分析鉴定技术；④血清中方剂显效成分与内源性标记物关联度分析技术（Plotting of Correlation between Metabolite Markers with SerumConstituent，PCMS）。其中，证候生物标记物发现及方剂体内显效成分与证候生物标记物关联度分析方法具有原创性。
“中医方证代谢组学”的英文为“Chinmedomics”，本研究团队于2011年底在Omics杂志刊文阐释“Chinmedomics”的详细内涵，并由爱思唯尔出版《Chinmedomics》专著；近5年相继在Mol Cell Proteomics、 Anal Chem及Sci Rep等权威刊物发表140余篇SCI论文（IF>10，1篇；IF>5，30 篇），被引3000余次，其中8篇论文被选为“ESI全球高被引论文”，1篇论文被英国皇家化学会评为同领域Top 1%高被引论文。目前，“中医方证代谢组学（Chinmedomics）”被国内外广泛接受并引用。2015年底，《自然》（Nature）杂志以Inside View 形式对其进行详细介绍（Nature，VOL528，Issue No. 7582）。该理论搭建了中医学与现代医学科学沟通的语言桥梁，对于深入认识中医药的有效性，提升中医临床经验的社会价值，推动中医药学术进步及新医学理论形成具有重要意义。 中医方证代谢组学研究策略示意图
2. 研究方向及研究方法
研究团队以中医方证代谢组学理论涵盖的相关技术内容为主要研究方向：
（1）证侯的生物学实质研究，即基于典型患者的证侯代谢轮廓、代谢指纹及生物标记物研究按中医证候诊断标准及专家系统对拟研究的证候患者进行诊断和收集，在正确中医证候诊断的前提下，收集患者的血清样品，并连续收集患者的尿液样品（晨尿、夜尿），利用UPLCHDMS-TOF/MS技术，对血清及尿液样品的小分子代谢产物进行无歧视分析，建立各证候患者群的代谢轮廓、代谢指纹，并鉴定各证的代谢生物标记物；对标记物再进行精准定量，确定证候标记物量变区间，利用代谢轮廓及代谢指纹进行证侯的宏观判断，利用标记物定量范围进行证候精准诊断。
在此方面，完成了国家自然科学基金重大研究计划“基于代谢组学的证候本质及方证相应研究”，解释了中医黄疸证的生物学实质，黄疸证的生物标记物研究发表在Mol Cell Proteomics[2012；11（8）：370-80；IF：7.25]，论文发表后，受到国际同行的广泛关注，被Ebiotrade和Escience重点推荐，迄今被引用123次。并应邀在美国洛杉矶2015 International Conference on Developments of Chinese Medicine等国际学术会议介绍本项工作。国家自然科学基金委员会网站以“解密黄疸证本质——我国学者利用代谢组学发现中医黄疸证的关键生物标记物”高度评价了本项研究。此后，相继完成了肝郁脾虚证、心阳虚证等中医证候，以及高脂血症、肝癌、酒精肝、肥胖等疾病的生物标记物研究，并在Hepatology [2013；57（5）：2072-7. IF：12.003]、Mol Cell Proteomics[2012；11（8）：370-80； IF：7.25]、Obes Rev[2013；14（4）：344-9. IF：7.859]、Sci Rep[2016；6：19333.IF：5.578]、Analyst[2012；137（2）：293-300.IF=4.10]等国际著名期刊发表相关论文50余篇。
（2）中药（方剂）药效的生物评价体系研究，即基于临床发现的生物标记物建立证侯相关动物模型，建立方剂药效的生物评价体系，并开展经方的有效性及其机制挖掘研究
中国（方剂）药效的生物评价主要以从临床病例获得的证候生物标记物为靶点，通过生物标记物的功能分析，代谢径路及相关关键代谢酶为指导，并结合功能蛋白分析，整合相关证候的中医学病因病机，以相关的现代疾病模为基础，复制中医证候相关的动物模型。在此基础上，利用代谢组学及UPLC-HDMS技术，建立证候相关动物模型的代谢轮廓、代谢指纹及生物标记物，以此作为方剂药效评价的依据，建立基于代谢标记物的方剂药效生物评价体系。
基于此理念及方法，参照阳黄证的40个生物标记物，以治疗阴黄证的主要中药（反治造模）及白酒（60度）加微量ANIT成功制备了阳黄证相关动物模型，通过代谢标记物研究鉴定了33个阳黄证动物模型的生物，其中含有临床上阳黄证的主要生物标记物胆色素原、二甲基鸟（嘌呤核）苷、L-γ-谷氨酰基-L-缬氨酸、S-（4-硝基）谷胱甘肽、苄基琥珀酸、鞘氨醇半乳糖苷硫酸盐等，体征及组织病理也与黄疸证直接相关；茵陈蒿汤治疗后，33个生物标记物的轨迹均回调接近正常动物水平，尤其是茵陈蒿汤通过对sphingomyelin信号通路的干预，阻断了肝损伤等黄疸证相关的病理过程，说明标记物与治疗阳黄的有效方剂有响应和对应关系，可用于阳黄证治疗方剂的药效评价。以此模式，参照阴黄证的49个生物标记物，结合治疗阳黄证的中药（反治造模）及白酒（60度）加ANIT成功制备了阴黄证黄证相关动物模型，鉴定生物标记物39个，主要包括3-甲基鸟嘌呤、甘氨胆酸、N-甲基-1-萘甲胺、3-甲基-2-氧-吲哚、氧化N-甲基-1-萘甲胺、3，5-二羟基苯乙酸、氨基甲酸酯、5-L-谷氨酰（基）牛磺酸等，以治疗阴黄证的经方茵陈四逆汤干预此模型，其代谢轮廓及主要生物标记物轨迹均回调接近正常动物水平。此项研究工作发表在Chin J Integr Med[2011；17（5）：369-75]，还相继在Mol Cell Proteomics[2013；12（5）：1226-1238；IF：7.25]、Sci Rep[2014；4：6768]及Liver Int[2014；34（5）：759-70] 等国际权威期刊发表相关文章30余篇。系统的研究成果获2012年度中国中西医结合学会科学技术一等奖等。
（3）中药血清药物化学研究，即方剂有效状态下方剂体内成分显效形式的分析鉴定
中药血清药物化学是20世纪90年代初，王喜军教授提出并建立的从口服方剂后含药血清中药物体内成分的研究设计，经过大量实践，提出了“中药血清药物化学”理论及研究内容。并将中药血清药物化学定义为：以经典的药物化学研究手段和方法为基础，运用现代分离技术及多维联用技术，分析鉴定或表征口服中药后人/动物血清中移行成分，阐明其活性与中药传统药效相关性，确定中药药效物质基础并研究其体内过程的应用科学。“中药血清药物化学研究方法的建立与实施”获2002年国家科技进步二等奖。该方法超越了体外生物活性导向分离不能反映药物体内生物转化及方剂中药物成分在吸收过程中的相互作用的方法学障碍，实现了中药有效成分研究方法学的进步。21世纪初，王喜军教授又将代谢组学发现证候标记物与血清药物化学分析体内成分同时一体化完成，评价方剂疗效的同时，利用血清药物化学发现并鉴定方剂有效状态下的显效形式，并将其与证候生物标记物轨迹变化相关联，发现与临床疗效相关的药效成分。在此方面，完成了茵陈蒿汤、六味地黄丸、酸枣仁汤、温心方等14个方剂的体内有效成分的系统研究，发表60余篇SCI论文，被引2000余次。基于该理论及方法，研发了国家创新药物越橘有效部位群（V类）及金柴胶囊（Ⅵ类），已获国家临床批件，完成Ⅱ期临床研究。另外，利用中药血清药物化学方法，发现了有效抗斑枯病真菌的中药活性部位，并在此基础上发明药用植物斑枯病的无公害防治技术，解决影响中药材大面积生产的关键技术问题。“人工种植龙胆等药用植物斑枯病的无公害防治技术”获2009年国家技术发明二等奖。
（4）方剂体内直接作用物质与效应生物标记物的关联度分析
该项工作是中医方证代谢组学的核心技术之一，也是收官环节；即建立一种数学模式，将方剂在有效状态下体内成分的动态变化（经时变化规律）与证候生物标记物在方剂作用下的动态变化规律相关联，挖掘影响证候标记物轨迹变化的体内直接作用物质，将其作为潜在药效物质基础进行生物学验证，从而确证表达临床疗效的体内药效物质基础。研究团队基于大量代谢组学研究及方剂体内成分分析，以及药效验证，依据皮尔逊相关分析及模式识别方法，建立了表达方剂体内成分与证候生物标记物关联度PCMS分析方法，为发现与临床疗效相关的药效成分提供新途径。采用该技术研究发现金匮肾气丸对肾阳虚证10个核心代谢生物标记物（肌酐、黄尿酸、苯丙酮酸、苯乙酰甘氨酸、牛磺酸、N-乙酰神经氨酸、α-亚麻酸、N-乙酰血清素、犬尿酸和皮质酮）具有显著回调作用，主要引起激素合成、色氨酸代谢、苯丙氨酸和酪氨酸代谢、脂肪酸代谢、磷酸甘油脂类代谢途径恢复。在金匮肾气丸治疗肾阳虚证有效性的基础上，对金匮肾气丸的血中移行成分进行了分析鉴定，发现并表征了19个血中移行成分。PCMS相关分析发现其治疗肾阳虚证的关键化学物质主要为木脂素类（五味子醇甲、戈米辛D、五味子酯甲、南五味子内酯B）、香豆素类（香豆素、滨蒿内酯）、黄酮类（二氢槲皮素）和生物碱类（甜菜碱、光千金藤碱）。该项研究已发表在Sci Rep（2016；6：19333. IF：5.578），并应邀在2015 The 8th International Conference on Traditional ChineseMedicine and Natural Medicine等国际学术会议介绍该项工作。受邀为行业权威杂志TrAC Trends in Analytical Chemistry（2016，76：86-94. IF：6.472）撰写“Discoveryand development of innovative drug from traditional medicine by integrated chinmedomicsstrategies in the post-genomic era”的主题综述，被该杂志审稿专家高度评价：Theauthors introduce a serum pharmacochemistry analyzing method calledchinmedomics，which is used for new drug discovery from traditional medicine.Obviously，the author’s group has achieved serial development based on thismethod。 二搭建的中医方证代谢组学研究技术平台
研究中心以代谢组学、中药血清药物化学和体内成分与生物标记物关联度分析技术三大关键技术为依托，形成了中医方证代谢组学的方法及技术平台，开展了黄疸证、肾阴虚、肾阳虚、心阳虚、实热证、心气虚、失眠症、消渴证、肝郁脾虚、气阴两虚证等生物标记物研究，阐明相关方剂茵陈蒿汤、茵陈四逆汤、六味地黄丸、知柏地黄丸、肾气丸、温心方、黄连解毒汤、酸枣仁汤、生脉饮及天芪降糖胶囊等方剂治疗上述相关病证的整体疗效及药效物质基础，并阐明中药的有效性及复方配伍的科学意义。
1. 中药血清药物化学技术
中药血清药物化学（SerumPharmacochemistry of TCM）是以经典的药物化学研究手段和方法为基础，运用现代分离技术和多维联用分析技术，分析鉴定或表征口服中药后人/动物血清中移行成分，并阐明其活性与中药传统药效相关性，确定中药药效物质基础并研究其体内过程的应用学科。
建立了利用UPLC-HD/MS等联用技术，分析表征口服中药或方剂后体内直接作用物质的技术平台，包括给药样品制备技术、生物样品制备技术、生物样品（血清、尿液、胆汁、脑脊液等）中药物成分辨识和鉴定技术、中药体内全成分同时定量监测技术等。 中药血清药物化学的研究思路示意图
2. 代谢组学技术
代谢组学是研究生物体系受刺激或扰动后其内源代谢物质种类、数量及其变化规律的应用学科。它既能够以代谢轮廓宏观诊断证候，以代谢指纹准确把握证候变化，又能以生物标记物的含量变化微观精准地表征证候各阶段的生物学特征，并以此反映方剂的治疗效应。中医药代谢组学研究核心是以典型证候患者群或相关模型动物的体液（尿液、血液、唾液等）为样本，以UPLC-HD/MS等联用技术，分析揭示证候或模型动物的代谢轮廓及代谢标记物；以代谢轮廓宏观表征证候/模型动物的整体特征，以代谢标记物的质与量变化微观表达证候/模型动物的精细特征；并通过生物标记物的关键代谢酶/代谢径路阐释证候/病的生物学机制。 代谢组学研究思路示意图
3. 体内成分与生物标记物关联度分析技术
采用经典皮尔逊数学模型，对体内方剂成分暴露量的变化与代谢生物标记物表达量的变化进行高效筛选和定量评估，并用Heatmap表征两组变量间的关联度，揭示与代谢生物标记物高度关联的血中移行成分，进而根据关联度确定潜在药效物质基础。该方法命名为“血清中外源性中药成分与内源性生物标记物关联度分析（Plotting of Correlation between Marker Metabolites and SerumConstituents，PCMS）”，已获国家软件著作权（2015SR164324）. 血清中外源性中药成分与内源性标记物PCMS关联度分析 三科研团队及科研支撑条件
以王喜军教授为学术带头人的科研团队设有专职科研人员7人，其中正高级职称2人，副高级职称2人，中级职称2人，初级职称1人；具有博士学位6人，硕士学位1人，博士学历占85.7%；博士生导师2名，硕士生导师2名；在读博士研究生19名、硕士研究生26名。
中心建筑总面积1800平方米，按照实验室功能下设中药血清药物化学室、代谢组学室、药代动力学室、细胞生物学室、生物活性室、中药质量分析室、实验动物室、中药创新药物室、药用植物生物学室、学术活动室等。现配备仪器设备总值达3000余万元，包括6台超高效液相色谱串联质谱仪及高效液相色谱仪、气相色谱质谱联用仪、流式细胞仪、酶标仪、实时定量PCR仪、小动物行为轨迹追踪系统等分析仪器和细胞生物学、分子生物学研究设备。
研究中心现有国家三级实验室“中药质量评价与血清药物化学实验室”、黑龙江省重点实验室“中药血清药物化学重点实验室”、黑龙江省教育厅重点实验室“中药材规范化生产及质量标准实验室”、国家中医药管理局“中药血清药物化学重点研究室”和“黑龙江省GAP研究中心”实验室，达到国家各级实验室的验收标准。 四主要科研成果及国内外技术交流与合作
近10年来，中医方证代谢组学研究中心共承担国家自然科学基金重点项目、国家自然科学基金面上/青年项目、科技部重大新药创制、国家973项目等国家课题16项，省部级课题15项；获得国内外专利18项；发表论文321篇，其中SCI收录论文160余篇，其中单篇最高影响因子12.003；主编和参编著作13部，其中英文著作《Chinmedomics》已由Elsvier出版；获国家科技进步二等奖2项及国家技术发明二等奖1项，省部级奖励8项，厅局级奖励6项；已培养博士生30名、硕士生150名，出站博士后9名。
研究中心秉承开放原则，通过多渠道与国内外科研院所开展技术交流与合作，与日本富山大学、北海道药科大学、名古屋市立大学、奥地利格拉兹大学、维也纳大学、英国Westminster大学等建立了良好的科研合作关系，积极开展中医药的国际合作研究，推进中药国际化进程。
中医方证代谢组学研究中心在继承和发扬传统中医药优势及特色的同时，创新思路，充分利用现代科学技术和手段，创建研究新模式、新方法，提高中医药研究水平；以中医药基础和应用研究为出发点，密切与国内外科研院所合作和交流，促进中医药现代化与国际化进程；培养多学科复合型人才，优化团队结构，加强梯队建设，为中医药的现代化进程贡献一份力量！
（□黑龙江中医药大学中医方证代谢组学研究中心 供稿）
发表于 2017-11-3 11:55:53
收藏